論文のエピローグ
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https://www.jstage.jst.go.jp/article/jsb/62/2/62_2_255/_pdf
ヤクルト中央研究所基礎研究II部
松木 隆広
本稿では，菌属・菌種特異的プライマーを用いた定量的PCR法による腸内フローラ構成菌の解析について，これまで取り組んできた研究を中心に紹介した。
微生物の系統分類および腸内フローラの構成菌の研究は，分子生物学的手法の導入によって，この10年間で大きく進展したといえる。
今後の10年では，上述のように特定の疾病に関与する腸内フローラ構成菌の探索，腸内フローラの生理作用の研究，細菌間コミュニケーションの解明，宿主の相互作用
の研究が進展していくものと考えられる。
定量的PCRをはじめとする分子生物学的手法によって腸内フローラの構成が明らかになったことは，これからの研究の基礎となるものであり，今後腸内フローラとヒトの健
康や疾病との関連が，より具体的に明らかになっていくものと考える。
便中の細菌分布
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ヤクルト中央研究所基礎研究II部
松木 隆広
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今後の腸内フローラ研究
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ヤクルト中央研究所基礎研究II部
松木 隆広
腸内フローラの構成が正確かつ簡便に解析できるようになったことから，今後この手法はこの微生物群集の活性や宿主との相互作用を調べる研究に応用されていくものと考えられる。
今後が期待される腸内フローラ研究としては，特定の疾病に関与する腸内フローラ構成菌の探索，腸内フローラの持つ生理作用の研究，腸内フローラの細菌間コミュニケーションの解明，腸内フローラに対する宿主の応答の研究，などが挙げられる。
特定の疾病に関与する菌の探索：特定の疾患患者の腸内フローラを網羅的に調べることによって，その疾病に関与する菌を同定できる可能性がある。
大腸がんと腸内フローラの関連は，培養法により1970年代から研究されており
(25)，最近では炎症性腸疾患と腸内フローラに注目した研究が盛んに行われている(13，24，30)。
また，アレルギー疾患と腸内フローラの関連についても多くの研究が行われ
ている(14，27)。
今後，これらの疾患に関連する菌の探索や関連性を検証する研究に，この手法が用いられていくものと考えられる。
腸内フローラの生理作用：腸内フローラの持つ生理作用については，これまで多くの報告があり，今後も新たな活性が明らかになっていくものと考えられる。
腸内フローラ構成菌が，未消化の栄養を代謝して宿主が利用できるエネルギーを供給することは以前から報告されているが(5)，最近この活性の違いが結果的に肥満と関係していることが報告され，注目されている(15，36)。
大豆に含まれるイソフラボンの一種（Daidzin,Genistin等）は，腸内フローラによ
りアグリコン化され，一部の人では更にエコールに変換される。
腸内菌によるエコール産生は，女性の乳がんおよび男性の前立腺がんの発生リスクと負の相関があることが報告されており(1，12)，エコール変換に関与する菌の探索が
進められている(6，37)。
また，糞便中の細菌由来の遺伝子すべてをクローニングして，そこに存在する遺伝子を調べる「メタゲノム解析」が進められている(10，16)。
この網羅的なゲノム解析によって，腸内フローラの新たな機能が
発見される可能性がある。
細菌間コミュニケーション：フローラ構成に影響する因子の解明も，今後の研究課題と考えられる。
食事（餌）や消化管構造，消化酵素の量などの宿主・環境の要因のほか，
細菌間のコミュニケーションもフローラ構成を規定する重要な因子のひとつであろう。クォーラムセンシング（細胞密度依存的制御機構）による遺伝子発現調節機構の研究な
どによって，フローラ構成に影響する要因が解明されれば，腸内フローラのバランスをコントロールして，疾病のリスクをコントロールできる可能性も考えられる。
宿主の応答：腸内フローラに対する宿主の応答の研究は，宿主・細菌双方のゲノム情報の蓄積によって，遺伝子レベルの網羅的解析が可能になりつつある。
単純な系ではあるが，すでにマイクロアレイを用いた解析によって，ある特定の腸内細菌の定着と宿主の遺伝子の発現量の変化が解析されている(11，31，33)。
Sonnenburgら（2006）は，Bacteroidesthetaiotaomicronの単独定着マウスを用いた実験で，菌の特定の遺伝子を欠損させることによって，宿主の遺伝子の発現量が変化することを報告している(33)。
したがって，ある腸内菌の特定の遺伝子が，宿主の腸疾患に関係する遺伝子の発現に関与していることが，将来明らかになるかもしれない。
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ヒト腸内フローラ構成菌の定量的PCR検出法の確立および菌属・菌種分布の解析
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ヤクルト中央研究所基礎研究II部
松木 隆広
ヒトの腸管内には多種多様な細菌が在住し，複雑な微生物生態系（腸内フローラ）が形成されている。
この腸内フローラの構成菌の解析は，主に培養法により行われてきたが，すべての菌株を培養できないこと，従来の分類・同定法は正確性に欠けること，多大な労力と時間・熟練を要すること，などの問題点があった。
そこで本研究では，腸内フローラ構成菌の同定・検出のために，16SrRNA遺伝子を標的とした菌属・菌種特異的プライマーを作製した。さらにReal-timePCR法と組み合わせることによって，標的菌の分布を健常成人について調べた。その結果，菌属レベルの解析ではClostridiumcoccoidesgroupやClostridiumleptumsubgroupがヒト腸内フローラの最優勢菌であることが明らかとなった。
また，Bifidobacteriumに注目した菌種レベルの解析では，最優勢の菌種がこれまで培養法で報告されていたものとは異なることや，乳児に特徴的な菌種が成人にも分布していることなどが明らかとなった。
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I.腸内フローラの検索法の開発
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https://www.jstage.jst.go.jp/article/jim1997/15/2/15_2_57/_pdf/-char/ja
光岡 知足 東京大学名誉教授
腸内は多種多様の細菌が互いに共生あるいは拮抗し合う複雑な栄養条件と強い嫌気的条件をもった環境であって,このような環境下で生息する腸内フローラを検索するため,われわれは,検体の採取,輸送,希釈などすべての操作中に細菌が死滅することのないよう留意し,検査材料を10倍段階希釈し,それを非選択培地ならびに選択培地に接種し,各培地を嫌気性または好気性培養し,所定時間培養後,各培地上に発育したコロニーの性状ならびに菌形態によって菌群を同定し,各菌群の菌数を算定するという方法で,腸内フローラの菌群レベルの構成を包括的に調べる手法を開発した(Fig.1)(43,45,55-58).
培地としては4種類非選択培地と10種類の選択培地(Table1)とを併用し,前者によって最優勢菌種を余すところなく培養し,後者によって腸内に少数しか存在しない菌群を選択的に培養する.また培養法としても,高度な嫌気性菌を培養するための方法としてPlate-inbottle法を開発した.
この方法によって,直接塗抹で計数される細菌の約70～80%までの培養が可能となった.最近,微生物生態系に生息する培養できない細菌を含むすべての細菌を,分子生物学的手法によって培養することなしに検出・同定・計数する手法が開発された.
RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism),FISH(FluorescenceinsituHybridization),
DGGE(DenaturingGradientGelElectrophoresis),insituPCR,NestedPCRなど"培養によらない腸内フローラ検索法"が検討された.ミュンヘン工科大学のSchleifer(1),Groningen大
学のWellingら(14)は,DNAプローブによるFISH法に自動顕微鏡画像解析を組み合わせた自動検索システムを開発し,すでに実用の段階に入っている.
また,ニュージーランドのTannockら(33,86)はリボタイビング法およびバルスフィールドゲル電気泳動法により腸内LactobacillusおよびBifidobacteriumの菌株の分布と変動の多様性を報告している.
わが国においても,ヤクルト・バイオサイエンス研究財団が研究班を組織し,腸内フローラの菌属・菌種特異的プライマーを用いたPCR法による自動検索システムの検討が進められ,まもなく完成の段階にきている.
腸内細菌学の歴史-1980～
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光岡 知足 東京大学名誉教授
1980年代になって,わが国では,腸内フローラの研究の成果は,機能性食品の研究に発展し(50,54,87-89),さらに,機能性食品の考えはヨーロッパ・アメリカにも導入され,プロバイオティクス(Probiotics)(16),プレバイオティクス(Prebiotics)(18)として,成人病(生
活習慣病)の予防に有効な食品として広まりつつある.
さらに,近年,腸内フローラの分子生物学的検索法の開発が進展している(Schleifer(1),Welling(14,32),Tannock(33)).腸内フローラの研究の歴史については,Dr.SavageがCurrIssuesIntestinalMicrobiology(2001)2(1)1-15に"MicrobialBiotaoftheHumanIntestine:ATributetoSomePioneeringScientists"(ヒトの腸内
フローラ:その先達研究者への賛辞)と題して詳細で見事な総説が掲載されている.
以下,まず,腸内フローラ研究の進展状況について,われわれの研究を中心に述べ,次いで,その研究が,今日の機能性食品の開発にどのように反映したか,また,今後,機能性食品はどのように発展していくかについて考察を加えたい.
腸内細菌学の歴史-1950～
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光岡 知足 東京大学名誉教授
1950年代から腸内微生物生態学の研究が開始され,スウェーデンのMidtvedt(21,39)らは無菌動物を用いた研究を行った.
東ドイツのHaenel(22-26),アメリカではDubos,Savageら(71-76,80,86),フランスではRaibaudら(65,66),また,イギリスではDrasar(11,12),Fullerら(17,86)によって,それぞれ,微生物生態学的研究がはじめられた.
われわれは,新たに開発された腸内フローラの検索法と腸内主要菌群の分類・同定法を駆使してヒトおよび動物の腸内フローラの生態学的研究を行い,多くの生態学的法則を発見するとともに,ヒトボランティア試験や無菌動物を用いたノトバイオート実験などによって,腸内フローラが宿主の健康・疾病に密接に関係していることを明らかにした(3-6,41-44,46,48,51-53,59,60,87-89,92).
この間約30年の月日が費やされたやがて,先進国に飽食の時代がやってきた.
平均寿命が伸びたためもあって,死因として,癌と心臓病が急増し,とくに西欧諸国における結腸癌・乳癌の発生率が高い原因が,欧米型食餌,すなわち,高タンパク高脂肪食にあることが指摘され,ここに,腸内フローラの健康と疾病における役割の研究がはじまった
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